六十年代末期，我以未来世纪的应用分子生物学为内容出过一套试题。问题之一是让报考者设计一种可催化专一的有机反应的酶，另一个问题是让他们设计一个用以某种酶的模板，以使三个特定的单体以1，2.3，1.2.3等顺序结合成一个多聚体。

现在我们能在多大程度上接近解答这些问题呢？基因操作的最新进展为此提供了手段，但是我们的理论知识仍然落在技术可行性的后面。不是像我提出的第一个问题那样：由纷乱中设计出一种新酶，成功更可能来自对一个已知酶的结构与功能的详细分析，并随之取代酶中少数几个关键氨基酸。这种改变可使此酶作用于其他的基质或使之抗热（绝大多数酶受热就不太稳定，而抗热的酶即使在环境温度下也显得更为稳定）。

已经用X - 线晶体衍射术测定了许多酶的结构。其中第一个是可破坏某些细菌膜的溶菌酶（一种由含有129个氨基酸的单链构成的酶），它是由亚历山大，弗来明（Alexander Fleming）在他患感冒时从其鼻腔粘液中发现的。此酶的结构在20年前已由伦敦皇家研究院劳伦斯 · 布拉格爵士实验室的菲力普斯（D. C. Phillips）及其同事们根据一份出色的X - 线分析而阐明。当他的学生解决了酶的结构时，布拉格曾问过他们“它能告诉你们些什么呢？”由于受到这个问题和一次紧急的皇家学会讨论的鼓励，菲力普斯和查理士 · 弗农（Charles Vernon）在一个下午的深入细致的研究中设法搞清了溶菌酶的作用。

已知溶菌酶可断裂细菌膜的多糖链。它把一个糖环的碳原子从与邻近的糖环上的另一个碳原子相连结的氧原子处切开。由菲力普斯及其同事搞清楚的结构表明：该酶有两个被一个V形裂口分隔开的区域（紧凑的球状单位），该裂口夹住多糖链并把在这化学钳子两个钳爪间的断裂的键连结起来。钳爪由一侧的天冬氨酸和另一侧的谷氨酸组成，前者带有负电荷，可把一个电子由多糖的第一个环上的碳原子推向起连结作用的氧原子，从而使原来的碳原子转变成带正电荷的碳鎓（carbonium，译注：指二价碳或三价碳的化合物中的碳）离子，此时对水分子和氢氧离子的攻击显得敏感起来。谷氨酸则给出一个质子到那氧原子上，形成一个羟基。由于溶菌酶和别的许多酶的结构得到阐明，证实了里纳斯 · 鲍林（Linus Pauling）1948年的论断：酶在结构上与其所催化的反应中的“活性复合物”是互补的——活性复合物是反应底物和反应产物间的分子形式的中间物，现在我们称之为过渡态。

多糖也能在水溶液中水解，不过通常需要加入比天冬氨酸和谷氨酸更强的酸类。它们是：怎样作为酶的一部分呢？在水溶液中离子是被水分子中的“电子売层”溶化的，水分子是偶极分子，通过把偶极分子具正电荷的末端指向负离子而补偿离子电荷，这样就遮护了它们欲攻击的分子中的酸。为了解决这个问题，化学家们使用了具低介电常数的有机溶剂（即那些具最小极性的溶剂分子），这样在反应物间就能产生强烈的相互作用。

酶具有一个很大的非极性内心，它能给活细胞提供为化学家们所欣赏的有机溶剂，当受到酶作用的称为底物的分子被驱入其内部时，酶的极性基团就能在没有遮护的水分子的情况下强烈地与其相互作用。酶能加速化学反应，还有另一个重要原因：在溶液中碰撞的两个分子间的相互作用可由于丧失各自的转动熵和平移熵而减低；另一方面，一旦底物分子与酶结合后，就能牢牢地被固定，不会再进一步丧失熵而减慢反应，这种熵因子能使反应速率比在溶液中高出几千倍。

去年以前，经典化学是唯一能检验酶催化理论的手段。可是，遗传工程已经打开了探求酶如何作用的新的途径。因为我们目前已经能够应用指定位点诱变的新技术随意改变酶的结构，一旦了解—个蛋白质的氨基酸顺序，就不仅可从细菌或酵母菌的基因组中，甚至可从几万个人体基因中分离出编码它的基因，然后把这基因引入大肠杆菌、酵母菌或蛙卵中，转录出可作为合成该酶模板的信使RNA。通过许多巧妙的方法，例如给基因加上前缀（译注：即在编码蛋白质的结构基因前加上可使其表达的调控基因），微生物就能大量地制造出这些酶来！而当细菌能有效地合成野生型酶时，研究人员们就能随意地将突变引入重组体DNA，例如在DNA中取代一个核苷酸碱基就能把氨基改中的天冬氨酸改变成天冬酰胺，它们具有相似结构故均能形成氢键，但是后者缺失了一个负电荷。

我的同事荷美 · 海林加（Homme Hellinga）和费尔 · 伊万斯（Phil Evans）用这种方法探明了磷酸果糖激酶的作用机制。此酶参与产生能量的糖酵解途径。它把一个磷酸由三磷酸腺苷（ATP）转移到6 - 磷酸果糖，形成1，6 - 二磷酸果糖。其活性位点被修饰成：果糖中的一个羟基（由一个氧原子和一个氢原子组成）和ATP中的7 - 磷酸正好彼此紧挨。为了形成鲍林所称之为的活性复合物或者我们现在称之为的底物过渡态，果糖分子的羟基中带负电荷的氧原子必须攻击ATP中带正电荷的磷原子，海林加和伊万斯推测：相邻的天冬氨酸经过由其负电荷把质子驱去羟基，使氧原子更具负电因而更为活跃，从而激活这个反应，天冬氨酸具有强烈的静电效应，因为它由水中脱出，而且与羟基相距只有0.3纳米（译注：即毫微米）。利用磷酸果糖激酶基因中单个碱基的取代，他们把天冬氨酸变成不带电荷的天冬酰胺，其结果是酶丧失了活性。另一些生物化学家用相似的方法已经阐明：在二氢叶酸还原酶、枯草杆菌蛋白酶、胰蛋白酶等催化的其他反应中，也有着由藏在内部的天冬氨酸所起的这种极其重要的作用。

其他研究者则注意到在酶与底物间形成的氢键的重要性及其对反应速率的影响，设在剑桥的医学研究委员会分子生物学实验室的葛兰克 · 温特（Greg Winter）及其同事和伦敦的帝国学院的阿兰 · 弗许特（Alan Fersht）和戴维 · 勃洛（David Blow）及其同事已经对酶的这方面的活性部位作了最深入的探索。他们研究了酪氨酰 - tRNA合成酶，此酶催化酪氨酸掺入增长中的多肽链的最初两步，第一步：把腺苷酸由ATP转移到酪氨酸的羟基，形成富含能量的酪氨酸腺苷酸；第二步：把酪氨酸转移到酪氨酰 - tRNA中，X。线分析提供了能催化第一步反应的活性位点的详细图像，不过第二步反应的位点仍然未知。

伦敦和剑桥的研究小组发现：当酪氨酰腺苷酸处于酶的活性部位时，酶与底物间形成多处接触，其中至少8处为氢键连结，这些键对稳定过渡态究竟起多大作用？在不带电荷的氮 - 氢和碳 - 氧基团之间的氢键能为21千焦耳/分子，它大约是共价的碳 - 碳键含能的十分之一，不过在酶 - 底物复合物中的氢键能量少得多。这种情况是由于在复合物中结合形成氢键的基团当酶和底物都游离时也能和水形成氢键，换句话说，稳定过渡态的自由能是由连结酶与底物的键能和在酶与底物未结合前水与它们连结的键能之差决定的，酶的过渡态键相对于水 - 底物和水 - 酶间键来说愈强，则反应愈快。

以酪氨酰腺苷酸中的酪氨酰羟基作为一个例子。这个基团和酶176位置上的天冬氨酸和34位置上的酪氨酰羟基形成氢键，弗许特及其同事依次测定了由苯丙氨酸取代其中一个位置上的酪氨酸，以及两者都被取代时所形成的键能。苯丙氨酸与酪氨酸差别仅仅在于前者没有可以形成氢键的羟基。他们发现底物的羟基与带负电荷的天冬氨酸之间的键能至少有15 ~ 20千焦耳/分子，这样的键能可成千倍地加速反应的速率。另一方面，不带电荷的供体与受体间（例如酶34位置上的酪氨酸和底物的酪氨酸之间）的氢键所具能量通常只是2 ~ 6千焦耳/分子，因此其加快反应速率至多不超过10倍。

弗许特及其同事设计并完成的一种氨基酸取代确实提高了酶的效率。两个氨基酸即48位置的组氨酸和51位置的苏氨酸构成面向活性位点的α - 螺旋（蛋白质链缠绕成螺旋），脯氨酸（另一种氨基酸）不适于α - 螺旋线，以致使它们形成扭曲，因此51位置的苏氨酸被脯氨酸取代后，预期能改变48位置处的组氨酸和酶中核糖上的氧原子的接触。当他们制备出该种突变型酶时，发现它能改善与ATP的亲和性，更有甚者，48位置的组氨酸与过渡态底物相互作用的自由能几乎较正常者高出三倍。构建较野生型酶更能有效催化的突变型酪氨酰 - tRNA合成酶是一项惊人的绝技，使人们建立起可能是走向构建新酶的第一步的信心。

不过设计完全崭新的酶的打算仍属空想。尽管一些有才能的科学家研究了许多年，决定一条具有特定氨基酸排列顺序的多肽链的空间折叠的规律仍然未知，因此我们还不能指定使多肽链形成选定的催化位点的顺序。目前我们尽最大努力所能做到的是搞清楚自然界中新的酶活性是怎样产生的？

考虑到这点，我一直在研究脊椎动物血红蛋白是怎样演化得能适应它们各自的环境以及嗜热细菌的酶是怎样适应高温的？所有脊椎动物血红蛋白把氧气从肺内带到各组织中，不过它们对其他化学刺激的反应在各个纲各个门之间有着很大变化，例如，哺乳动物血红蛋白对氧的亲和性是由有机磷酸盐调节的，后者使氧在组织中释放出来 · 可是西德雷根斯堡的克里斯丁 · 鲍尔（Christian Bauer）发现：在鳄鱼中氧亲和性是受碳酸氢盐离子调节的，因此在氧和氧化代谢的最终产物CO₂间有着直接的互换作用。当鲍尔告诉我这个发现时，我就想知道化学亲和性的这种剧烈变化是需要血红蛋白分子发生涉及到许多氨基酸取代的很大的结构变化，还是只需要某些关键位置的少许变化。令我吃惊的是：这并无很大的结构变化，只需要4个氨基酸取代就能把人类血红蛋白中可接受有机磷酸盐分子的一个连结位点转变成凯门鳄（Caiman crocodilus）血红蛋白中可接受碳酸氢盐离子的两个连结位点。

罗马的勃罗诺里（M. Brunori）及其同事们发现：鲑鱼有两种不同的血红蛋白，其中一种的氧亲和性受氢离子和有机磷酸盐控制；另一种则对这些调节因子不敏感。在比较了它们的氨基酸顺序后，他指出：开闭这些调节机能仅仅需要不多于5个氨基酸取代。

另一个有兴趣的问题是：绝大多数脊椎动物蛋白质在高于55°C时就要变性，而生活于热温泉中的嗜热细菌的蛋白质却能抗更高的温度。雷特（H. Raidt）和我发现嗜热脂肪芽孢杆菌中的酶——铁氧还蛋白对热的稳定性是由于10个氨基酸取代造成的，这些改变在该酶表面带相反电荷的侧链间造成了6个添加氢键，而其内部结构仍保持不变。

伦敦大学的帕特里夏 · 克拉克（Patricia Clarke）用不同方法研究了这个问题，她研究了最能适应环境的微生物——绿脓杆菌，把它们置于设计为使其能生长于新的碳源的选择压力下，她的野生型菌株能很好地生长于乙酰胺上，寸是不能生长于其链较长的酰胺上，不过可使其体内一种酶中的丝氨酸被苯丙氨酸取代的单个点突变却能产生一种可生长于丁酰胺上的菌株，进一步的单个突变可产生能生长于苯乙酰胺的菌株，但这菌株却丧失了生长于乙酰胺上的能力。伦敦的帝国学院的勃莱恩 · 哈特雷（Brian Hartley）等人用木糖醇替代其“天生的”糖源——核糖醇来培养产气克氏杆菌，他们发现：一个其体内核糖醇脱氢酶娃因发生点突变的新菌株增加了此酶对木糖醇的亲和性。

我所举的例子表明：调节蛋白质活性或产生新的酶活性的一些新方法是利用了可导致少数关键位置的氨基酸取代、但整个蛋白质结构仍保持稳定的少数突变。化学家们应该能通过设计完成随机突变和自然选择所起的作用。正如弗许特及其同事已经做的那样，设计与制造新的蛋白质的成功似乎来自于对已有酶的结构和作用机制进行详细分析，以及随后在其关键位置造成少数氨基酸取代以使此酶对底物的特异性有所变化，例如使之更为抗热。

对工程师来说使酶抗热可能是最容易的了，因为在酶表面具相反电荷的侧链间引进少数几个添加氢键是比较容易的。圣迭戈加里福尼亚大学的乔 · 克兰乌特（Joe Kraut）约翰 · 艾勃生（John Abelson）及他们的同事已经试着用稍微改变的方法增加酶的抗热性，他们通过插进一个二硫（S-S）桥交联起二氢叶酸还原酶的两段多肽链，对此结构的X线分析表明，这样的桥并不使酶变形，而是使之稳定。不过实际上二硫桥降低了酶活性，或许因为这儿需要某些酶的灵活性。这个例子指出；酶工程可能有着许多未曾预料到的风险，其成功将需要很大的运气。

[New Scientist，1985年106卷1406期]