肺癌是当今社会发病率最大的恶性癌症之一。据美国癌症学会数据，2020年全球肺癌发病人数为220万，居恶性肿瘤第二位，死亡人数为180万，居恶性肿瘤第一位。肺癌按照组织病理学类型可分为小细胞肺癌（SCLC）和非小细胞肺癌（NSCLC）。液体活检算是临床上病人经常看见却不太了解的检查之一。我国恶性肿瘤发生率不断增加，但受限于当前检验设备的多种原因，肿瘤筛选与检测的敏感性、特异性不理想。随着液体活检技术的进展，癌症的早筛、早诊获得了诸多突破性进展。液体活检具有高特异度、高灵敏度、高性价比的特点，可以同时检测多种癌症，并提供准确的组织溯源结果，被认为是下一代癌症早筛技术的突破口，得以不断发展和推广使用。
什么是液体活检
液体活检（liquid biopsy），也称液态活检或液相活检，是一个相对于组织活检的概念，是指以体液为检材获得肿瘤生物信息的体外诊断技术。可用于液体活检的体液包括血液、尿液、脑脊液、胸腔或腹盆腔积液等。目前医学与科研工作中较常用的血液活检测试项目根据检测对象一般分为循环肿瘤DNA（ctDNA）、循环肿瘤细胞（CTC）及外泌体等。
其实，液体活检的前身由来已久，早在1869年CTC便在癌症患者的血液中被第一次发现。但是由于技术的限制，液体活检进入商业应用却是在一个世纪之后。 液体活检于1994年由一个叫作Immunicon的公司创造，很快该公司被强生子公司——Veridex收购，随后Veridex公司在2000年首推一款名为CellSearch的商业液体活检测试。2004年，一款叫作CellSearch循环癌症细胞检测系统的产品得到美国食品药品管理局（FDA）许可，用于转移性结直肠癌、乳腺癌和前列腺癌的CTC筛查。2011 年基于 CTC 检测的液体活检概念被提出来，此后利用循环肿瘤 DNA检测基因突变获取肿瘤生物学信息的技术被引入液体活检技术。2014年，欧盟批准利用 ctDNA 检测 EGFR 突变可用于肺癌靶向治疗（易瑞沙）的伴随诊断。同年，可用于早期大肠癌血液检测的Septin 9基因甲基化检测试剂盒通过中国国家药品监督管理局（NMPA）审核，获得中国进口医疗器械产品注册证，将液体活检的应用拓展至肿瘤早筛领域。2015 年，液体活检被《麻省理工科技评论》评为年度十大突破技术。在这以后，液体活检技术开始高速发展。外泌体和肿瘤诱导血小板等的检测也纳入液体活检范畴。2016年，美国FDA批准了基于荧光定量 PCR（qPCR）技术的用于肺癌 ctDNA 突变检测试剂盒。2018年中国国家药品监督管理局首次批准血浆 EGFR 基因突变检测用于非小细胞肺癌患者的临床评估，标志着我国液体活检进入了新的发展阶段。2019年一种用于检测前列腺癌筛查的外泌体液体活检技术获得美国突破性医疗器械认定。2020 年，首个基于二代测序（NGS）的液体活检产品获得美国 FDA 批准，用于实体瘤综合基因组分析和肺癌伴随诊断，进一步指导临床治疗决策。2021年ctDNA 液体活检获得纽约州卫生部临床实验室评估项目的许可， 可用于实体瘤微小残留病变（MRD）的检测，拓展了液体活检的临床应用范围，标志着液体活检技术的发展进入了一个新阶段。2021年 7 月，中国国家药品监督管理局批准了 CytoSorter? 循环上皮细胞分离仪获得三类医疗器械注册证，该产品基于微流控和免疫捕获技术，通过对肺癌、乳腺癌、结直肠癌、前列腺癌等多中心临床试验验证，在临床上用于人外周血中的循环上皮源肿瘤细胞进行分离富集。这在中国 CTC 领域，具有标志性意义。与此同时，伴随液体活检检测对象和临床应用领域的不断扩展，实时荧光定量 PCR、数字 PCR、高通量测序、微流控芯片等多种检测和分析手段也逐渐进入临床应用。
液体活检与传统的组织活检相比具有不少优点。组织活检可能引起病人出现气胸、脑出血等并发症，液体活检对就医患者的伤害较小，可以实时得到结果，并且可以在疾病的早期发现问题。如患者做普通穿刺活检损伤大，而液体活检则对患者的损伤更小，会较大的程度地减轻病人的痛苦。同时，在做液体活检的过程中临床医生可以用其来监测肿瘤对治疗的反应，预测预后、肿瘤复发及药物疗效。在一定时间内采集多个血液样本的可操作性使得医生能更好了解肿瘤在分子生物学层面的发生发展情况。另外，大约25%的肺癌活检由于获取的组织样品过少而影响患者诊断和病情评估，组织活检难以重复，获取的肿瘤信息受样本异质性影响较大，只能反映取材部位信息，而液体活检获取较为轻松，可以提供准确的组织溯源结果。但是液体活检对检测技术灵敏度和特异性要求高，质量控制难度大，在早期肿瘤患者检测结果与组织活检结果会存在不一致。目前组织活检仍是肿瘤分子诊断的金标准，在能获取组织样本的情况下，组织检测仍为首选，液体活检还不能全面取代组织活检，但是二者相互补充可为临床提供更可靠的结果。
液体活检的取材
液体活检的开展依赖于体液。体液是人体的重要组成部分，在成年男性和女性的所占比重分别为60%和55%。人体各种组织和器官通过体液不断进行物质和能量交换，维持机体功能正常运转，肿瘤来源的相关物质可进入体液中，为液体活检的开展提供了可能。
血液 血液是目前在液体活检中应用最广泛的样本类型，更重要的是作为人体进行物质和能量交换的枢纽，其中汇集了肿瘤细胞生长、代谢及凋亡（死亡）所释放的能够反映肿瘤生物学特征的物质。
尿液 尿液是除血液外可汇集全身代谢产物和各种组织相关物质的样本类型，尿液来源的脱落肿瘤细胞还可作为泌尿系统肿瘤检测对象。尿液收集时已在膀胱中储存过一段时间，成分相对稳定，质控相对容易。更重要的是尿液不像血液那样被内环境稳态的机制控制在一个稳定的范围之内，尿液收集更早期的变化，是早期标志物的更好来源。吸附干燥真空技术可用于在膜上保存尿液中的大分子成分，做到长期保存，为早期肿瘤标志物探索和鉴定提供重要的生物样本支持。
肿瘤局部体液 在肿瘤的原发部位或转移部位，肿瘤的侵袭会导致体液的渗（漏）出，包括胸水、腹水、脑脊液等。这些体液靠近肿瘤组织，含大量肿瘤来源的细胞及其他肿瘤相关成分，十分适合用来液体活检。胸腹水和脑脊液的获取一般需要通过穿刺引流，虽然有创，但可在治疗性引流同时获取，患者更好接受。在液体活检标本的选择上，这类样本的优先级更高，优于血液样本。
唾液 正常人每天分泌唾液大约为1.0～1.5 L。唾液中的有机物质一般是黏蛋白、淀粉酶等，含有游离核酸，可用于检测基因变异。目前的研究已经证实采用唾液样本进行液体活检的可行性。
其他体液 除了上述的体液类型之外，痰液、泪液、淋巴液、汗液、痰液以外的黏液、乳汁以及精液等也都是常见的体液标本，但是这些标本用于液体活检的报道少见。
液体活检的检测对象
液体活检的检测对象主要有游离核酸、肿瘤细胞、细胞外囊泡、血小板等。
循环肿瘤DNA（ctDNA） 在体内环境中，包括血浆、脑脊液、尿等，可以检查到一种游离的DNA片断，被称之为循环游离DNA。人体细胞在生理和病理情况下的凋亡和坏死会释放片段化 DNA，成为游离 DNA。它们既有来源于正常细胞的DNA，又有来源于癌症细菌的DNA，而它们又称之为循环肿瘤DNA，因为具有分解快的特点，其浓度的改变能够更精准地表达肿瘤负荷，为癌症检测、微小残留病灶预后研究、转移控制等带来关键数据。
循环肿瘤 RNA（ctRNA） 游离的长片段 RNA（mRNA、rRNA、tRNA、lncRNA）在体液中很易降解，循环肿瘤 RNA 主要指 microRNA（miRNA），负责调控转录后基因表达。人类目前已发现超过2 500种不同的 miRNA。每一种可直接或间接调节关键细胞进程，例如增殖、分化，DNA 修复和凋亡，发挥癌基因/抑癌基因的功能，因此可通过对其的检测补充肿瘤诊断。有指南提出tRNA可以作为肿瘤标志物，但个人观点，tRNA 因为无法区别来自正常细胞还是肿瘤细胞，较难作为肿瘤标志物。miRNA 在体液中较为稳定。血清 miRNA置于各种极端苛刻环境下，仍可保持稳定，且能长期储存。这些优势使循环 miRNA 成了非常有前景的生物标志物，但 miRNA 检测的特异性和重复性是临床转化需要解决的问题。多数 miRNA并不特异针对某一种肿瘤类型，因此，以单个 miRNA 作为某种肿瘤诊断或预后的生物标志物并不可行，多个miRNA 的组合（miRNA 表达谱）的定量检测可能更有应用潜力。
循环肿瘤细胞（CTC） 1869年，病理学家从肿瘤死亡病人血液中发现有一种细胞，其形状和癌细胞形态类似，将它命名为循环肿瘤细胞，它的主要来源为实体肿瘤病灶。原发或继发的实体肿瘤病灶自动脱离或受外科手术、切片取出等外部影响而被动脱离，使CTC作为肿瘤转移的“种子”进入外周血。CTC以不同形态存在于外周血中，既有游离的单个CTC，也有聚集成团的细胞团， 通过循环系统完成转移播散。肿瘤细胞突破基底膜进入血流形成循环肿瘤细胞是肿瘤进展的重要标志。这个细胞群体有异质性，彼此间在细胞大小和形状、分子表型、活力程度、转移潜力、繁殖潜力等各方面可能均有差异。作为恶性肿瘤远处转移的“种子”，CTC 在患者血液中出现与否及其数量多少，一方面代表着原发恶性肿瘤浸润入血液中的时间，另一方面预示着在较远端器官形成转移灶的可能性。CTC 在外周血中数量稀少，其稀有性和异质性为检测提出了极大挑战。获得数量和质量都能满足下游分析要求的 CTC 是开展相关检测和研究的先决条件。除外周血的 CTC 外，肿瘤局部体液也会含有大量肿瘤脱落细胞，这些细胞在数量上比 CTC 更多，收集相对方便，也是非常理想的液体活检材料。
外泌体（EVs） 外泌体为外表呈凹半球状的类囊泡小体，带有立体膜构造 ，口径大约为30～150 nm。外泌体广泛分布于各种体内环境，外泌体可以对其内含物质进行较好保存，使外泌体成为液体活检的重要潜在目标。肿瘤微环境能增加外泌体的异质化，改变外泌体大小及内容物的功能，促进外泌体释放，不同的癌症衍生的外泌体差异很大。外泌体的分离和纯化仍是一个技术挑战，目前耗时费力难以质控的分离纯化步骤仍然是外泌体液体活检临床应用的主要限制因素。
液体活检的取材和检测对象
肿瘤诱导血小板（TEP） 血小板细胞指直径为2～4 μm的无核人血细胞，取自人骨髓内的巨核细胞，半衰期短，仅为7～10天，在人体血液循环中数量仅次于红细胞。除了参与止血和血栓形成，血小板在癌症发展的全过程中有着至关重要的地位。在血液中，循环肿瘤细胞导致血小板凝聚，产生血小板细胞-肿瘤细胞复合体，帮助肿瘤细胞抵抗因血液剪接力造成的机械伤害和保护肿瘤细胞逃脱免疫系统的攻击。循环血小板在其整个生命周期内一方面与肿瘤细胞相互作用，获取肿瘤相关的生物分子；另一方面还可以不断摄取并富集循环中游离的蛋白质、核酸以及囊泡、颗粒等。经此，血小板如同被“教育”了一般，其蛋白质组和 RNA 表达谱发生显著变化，因此被称为"肿瘤诱导血小板"。同时得益于其封闭的膜结构，其获得肿瘤相关的生物学信息得以完整保存，成为肿瘤来源的生物活性分子的大而浓缩的生物储存库。基于以上这些原因，肿瘤诱导血小板成为肿瘤液体活检的新型检测对象。
小结
由于非小细胞肺癌靶向与免疫治疗的广泛应用，液体活检的相对非侵入方法对血浆或体液中癌症细胞和相应癌症分子标志进行检测成为最活跃的应用领域。CTC、ctDNA 以及外泌体是肿瘤液体活检最主要的三个检测对象。三者提供的检测内容不同，互为补充。液体活检的意义在于可对肿瘤的治疗过程进行动态检测，如治疗反应、进展、耐药确定。液体活检在即时性、准确度、无创性等方面都有着巨大的优越性。液体活检的无创性能够减少肺癌病人的恢复期，利用ctDNA、CTC和外泌体的探测方法能获得组织活检不能获得的动态数据，可以即时观察病人诊断后的症状改变以及推测病人的预后情况。医学上还无法把液体活检获得的数据当作唯一的依据，但是可以把液体活检和组织活检、影像技术及其他检验技术结合到一起进行病人的医学诊断。
本文作者张骁是上海市胸科医院胸部肿瘤研究所副研究员；马丽芳是上海市胸科医院检验科分子组组长，副研究员；王佳谊是上海市胸科医院检验科主任、输血科主任兼基础医学研究中心主任，研究员。