植物原生质体培养和融合技术的成功，及其在许多农作物品种改良中的应用，使我们在性不亲和的物种内进行优良性状的转移，已成为作物基因改良的切实可行的方法。
植物原生质体的培养和细胞融合技术的应用，克服了传统的作物育种方法中的障碍，使在性不亲和物种中的性状转移成为可能。现在，可以通过基因导入的方法将外源基因重组到作物的基因组内。虽然远缘不亲和的种间的融合会形成不对称的杂合体，并且减少可育性，但是，这种方法可以作为目的基因导入作物的桥梁，而且，两亲本细胞所有的细胞器的融合为细胞质遗传物质的修饰提供了可能性，因此说，原生质体融合是当今获得基因重组的最有效的方法。
原生质体培养的发展
从60年代起到现在，原生质体技术已经发展到能够应用于生产实践，大量的物种可以用原生质体再生、分化的途径获得完整植株，其中包括许多再生难度很大的单子叶植物（如水稻、玉米等）。在茄科中有许多广泛应用于原生质研究的种类，而且成功地进行基因杂交重组，其中不但有菸草属，曼陀罗属和矮牵牛属，而且还有茄属，番茄属。其他成功杂交的种有伞形科，特别是其中的胡萝卜及其近亲种，芸香科中的橙与同科内的其他基因组重组成功，在豆科中，苜蓿属、三叶草属和百脉根属等的多种饲料作物都被用于近亲种的杂交实验。最近，在谷类作物中，将水稻和稗草杂交形成杂合体。在十字花科中，大多数的种类较易进行原生质体培养，因此，十字花科植物是最利于原生质体技术的研究。在本篇综述中，通过十字花科植物的体细胞杂交实验，分析了体细胞杂交重组作物基因的可能性和局限性。
十字花科的原生质体——融合实验的经典材料
芸苔属是首先应用于原生质体分离的属之一，在植物体许多部位均可获得具全能性的原生质体。例如，油菜叶肉细胞原生质体的愈伤组织诱导和植株的再生，在70年代中期就被报道过。从那时期起，几乎所有的芸苔属的原生质体分离，以及从原生质体的植株再生都有报道。芸苔属的原生质体也因此而首先被应用于原生质体的融合实验，并获得成功。
蔓菁中基因变异的增长
首先在体细胞杂交中运用芸苔属时，其目的并非为了作物的改良，而只是为了进行不同种的杂交实验，例如，拟南芥一一芸苔杂合体的形成。接着，一种比较有目的性的方法应用于蔓菁杂合体的构建。尽管蔓菁可以直接由油菜和甘蓝经过有性杂交的途径获得，但是，杂合体的获得率是不稳寒的，有时候一无所获这种情况是由材料所处的环境、生理状态等因素引起的。因此，比较有效的方法是将甘蓝作为母本，油菜作为父本进行杂交，并利用胚胎发生技术构建蔓菁杂合体。但是，蔓菁的基因变化则因此而受到限制。
种间无性杂合体
在开始运用种间无性杂交的方法来构建蓃菁的过程中，也同样遇到了一些困难，如在1236个融合体中只有12个再生形成完整植株。而且对植株再生频率很低的原因还没有进行系统的研究，可能的原因是体细胞的不亲和性，杂交技术问题，或者培养条件的不适。在随后的原生质体融合中，利用两亲本的不同栽培品种融合成蔓菁，在许多实验中，成功地获得了含有预期染色体数的可育性杂合体，这表明完整的全能性杂合体可以通过无性杂交的途径获得，而且，无性杂交可以克服有性杂交中父本细胞器的缺失，使双亲的细胞器都能完整地保留在杂合体中。通过二倍体原生质体的融合，可以一步得到异源多倍体，而不再需要像有性杂交一样的染色体加倍，就可获得杂合性，而且在有性杂交中，染色体的加倍是通过单倍体的复制，因而减少了基因型的变异，而无性杂交则克服了这个缺点。
通过有性杂交获得的异源四倍体的方法，已经构建了多种芸苔属作物。一些异源多倍体不可能通过有性杂交的方法获得，但可通过无性杂交的方法来构建这些异源多倍体。
曾经试图将芸苔属中甘蓝、油菜、黑芥的三个基因组，通过有性杂交的方法融合在一起，结果没有成功。而当蔓菁（含甘蓝和油菜基因组）同黑芥的原生质体融合后，则形成蔓菁 - 黑芥的新品种，由此可见，无性杂交比有性杂交更能广泛地构建新品种。进一步的实验事实证明，蔓菁 - 黑芥的植株确实含有三个基因组的54条染色体，而且植株是可育的，同时含有这两种芸苔属植物的典型的同工酶。另外，几种由芸苔属二倍体基因组重组的品种也获得成功，如双3倍体蔓菁 - 甘蓝、双四倍体蔓菁 - 芥菜和蔓菁 - 龙骨菜等，通过无性杂交获得，并且能够形成高频发生的杂合体愈伤组织。含有大量预期染色体数的杂合体植株的再生及其具有相对较高的可育性说明了种间杂交的高亲和性。
属间无性杂交
利用基因入导的方法来转移农作物的优良性状合成新品种已有很长的历史，其中的萝卜 - 芸苔已经培育了二十年，但仍然存在着许多问题。例如，萝卜 - 芸苔是很有意义的饲料作物，但是较低的结实率限制了它的农业价值。相反的，蔓菁、小麦、棉花、玉米等的杂合体在自然条件下就能自发地生长发育。因此可以进行大量的筛选工作，选择有价值的功能特性而获得有实用价值的品种。总之，无性杂交最有意义的应用不是单纯地为了构建新的品种，而是作为将含有优良性状的外源基因导入作物的一条途径。
将目的基因转导到栽培品种的可行性已在几个原生质体融合中得到了证明。例如在芸苔族中，芝麻菜属、芥子泥属、双节属同蔓菁、芥菜杂交，所有的属间杂交均形成杂合体，且都获得可育的杂合体。然后，将杂合体同栽培品种回交，检测基因的导入与否，例如芝麻菜的抗干旱和抗虫害，芥子泥抗病毒性和双节的雄性不育。通过对芝麻菜 - 芸苔染色体数的研究，发现染色体的变异很大，变动范围从稍高于蔓菁的染色体数到预期的60条染色体。而且同工酶的分析表明一些再生植株是缺少部分基因材料的杂合体，有些情况下，芝麻菜的染色体全部丢失。在另外一些属间杂合体的构建中也发现了相似的结果。
染色体数的变异可能有如下几个原因：
1. 多次的融合形成大量的染色体。当用聚乙二醇（PEG）或电激法融合大批量的原生质体时，每个融合体中原生质体数是难以控制的。分析了用PEG诱导和电激诱导的融合实验，大约三分之一的融合产物是两个以上的原生质体融合的。
2. 当从分裂旺盛的组织分离出来的原生质体同静止组织分离出来的原生质体相融合时，也产生不对称杂合体。
3. 在异核体中，由于DNA复制的不同步性，因此染色体在杂合体中的分布不均一。
4. 在细胞的体外培养中，细胞染色体组的倍数也会发生变异，这种现象称为无性克隆变异。
所以，为了避免产生不必要的染色体组成的变异，选择良好的融合途径是非常必要的。
在芝麻菜 - 芸苔的杂合体中，大约有60%的植株都缺少一小部分染色体。这可能是由于两种间的关系比较远，在有丝分裂时形成不正常的染色体构型而导致染色体的丢失。
芝麻菜 - 芸苔无性杂合体在第二次回交后获得子代，瑞典的植物培养公司用子代在田间进行试验，检测基因转导情况。因为蔓菁的栽培品种含有较少量的芝麻酸，而芝麻菜中含有高浓度的芝麻酸，所以可以根据是否具有高浓度的芝麻酸来检测芝麻菜的优良性状有没有成功地转移到新品种中。
族间无性杂合体
利用原生质体融合的方法，育种工作者可以超越杂交过程中的局限性，克服远缘种间的性不亲和性，在生殖隔离的种间进行优良基因的转导。这种方法已应用于十字花科中不同族的原生质体融合。由于山芥和菥蓂含有优良性状（山芥的抗寒性能和高浓度的神经酸，菥蓂的可作为润滑剂的脂肪酸），因此我们选择山芥和菥蓂作为蔓菁的融合亲本。同拟南芥 - 油菜相比较，由分离获得的菥蓂 - 蔓菁和山芥 - 蔓菁的杂合体的愈伤组织很容易再生芽，在离体培养的条件下能正常生长，只是根的发生和芽转入温室培养尚有一些困难。同工酶和限制性酶切片段长度的遗传多态性（RFLP）分析表明，在山芥 - 蔓菁和菥蓂 - 蔓菁中都形成不对称的杂合体，一部分菥蓂 - 蔓菁杂合体同蔓菁回交可以获得种子。这种情况的发生机理尚不清楚，需要对基因重组构建和目的性状的遗传作进一步的研究。
当然，在无性杂合体中，染色体的重组，特别是染色体的丢失现象是经常发生的，然而，这些杂合体同以前报道的相反，虽然含有不对称的基因组成，却能够发育成为表型正常的植株而且具有一定的结实率。因此，我们可以利用这类杂合体作为转移野生品种中优良性状到农作物的“桥梁”。
通过不对称杂合体的诱导和选择转移基因
由于性不亲和的远缘亲本的基因材料的不同组合而形成不对称杂合体，利用这类杂合体可以达到有限外源基因的转导。因为染色体的重组和丢失是随机的，所以通过对不对称杂合体的选择可以得到带有目的基因的优良杂合体。当然，只有通过基因导入的途径将目的基因整合到受体基因组中而形成的杂合体才是稳定的，例如、将抗黑胫病的外源基因转导到蔓菁中形成杂合体，然后通过选择产生抗病植株。这种黑胫病是由活力茎点霉引起的，这是一种世界性的农业病，它对蔓菁和芜菁的农业生产有很大影响。如果它的菌丝侵入植物的茎中，则茎就会腐烂，整个植株因此而枯萎死亡。如果用化学的手段去控制这种疾病是非常不易而且耗资大，而用基因转导的方法则非常有效。利用基因转导这一方法，在黑芥、龙骨菜和芥菜等中均获得抗性的植株。黑胫病抗性基因可能在黑芥的基因组内，但由于这基因尚未定位，因此，现在抗性基因的转导只能通过体细胞杂交的途径。
现在，从体外培养的活力茎点霉培养液中分离出一种毒素，而且弄清了这毒素的化学结构。利用这种毒素，可以在细胞及整体水平上选择对真菌有抗性的材料。为了促进有限的基因转导到蔓菁中去，在细胞融合前，我们先将具抗性的供体系进行辐射处理，促使染色体的断裂和丢失，使杂种细胞在重组形成中，抗性基因更易整合到敏感型受体蔓菁中去。在细胞融合以后，我们将融合体克隆，然后在选择性毒素的作用下，选择出抗性的愈伤组织，再将抗性愈伤组织在一定条件的诱导下再生植株，同时检验植株的抗病性能。结果大部分的植株表现出抗性，这表明了在杂交融合过程中发生了抗性基因的转导，但有的结果出现相反情况，就是大部分的再生植株不具有抗性。通过对染色体数，同工酶和限制性酶切片段长度的遗传多态性分析，发现通过辐射处理后，供体基因出现丢失现象，因此在杂合体的子代中，有的获得茎点霉抗性，有的则没有。抗性的丢失的主要原因可能是辐射后的供体细胞在减数分裂过程中发生染色体的丢失而导致抗性基因的丢失。总之，抗性子代的存在表明，利用一定的条件，选择不对称杂合体是特定性状基因（尚不清楚其特征）转导的非常有效的方法。
胞质杂合体的构建
原生质体工程技术的发展，为高等植物细胞组成的修饰提供了令人鼓舞的可能性。在高等植物中，一些农艺上的重要性状是由细胞器控制的。例如，CMS、抗除草剂、抗真菌毒素和花蜜生产等。许多农艺上的重要种类在以往的有性杂交时，调节花粉中细胞器的转移一般不可能发生。但是，最近的工作表明，通过有性杂交的途径获得了含有雄性亲本细胞器的植株。另外，利用细胞融合的方法，获得了包含双亲细胞器的杂合体。在此前提下，由细胞器编码的性状也可进行新的组合。
当我们用原生质体融合的技术时，一次就可成功地转移全部的细胞质，而用有性杂交的方法，则需要七次的回交。由此可见，原生质体的工程技术为我们节省了大量的人力、物力和时间。融合后的原生质体中，两亲本的细胞器（线粒体和叶绿体）可以独立合成，但有的情况下并非如此，如在有丝分裂时出现“选择”现象，后代中只含有两亲本叶绿体和线粒体中的一种（如，叶绿体来源于一亲本，则线粒体来源于另一亲本）。这种细胞质的互换现象可应用于改善蔓菁的质量，如含有Ogura细胞质（一种从萝卜分离出来的细胞质，能在小萝卜和蔓菁中引起CMS）的蔓菁系。由于蔓菁核和萝卜原生质体的不相容性，引起这个CMS系出现叶绿素的缺乏现象，因此植株生长不正常。当将含有Ogura细胞质的蔓菁原生质体与蔓菁或油菜（两者都含有油菜的原生质体）相融合，结果叶绿体被取代而线粒体（相应于CMS）保留下来。因此，叶绿素的缺失现象克服了，植株生长旺盛。又如，这种来源于不同亲本的线粒体和叶绿体的组合方法应用于抗阿特拉津和CMS的杂交，将含抗阿特拉津叶绿体的油菜和含CMS的甘蓝进行原生质体融合。这些含有两亲本优良性状的蔓菁，如果用有性杂交的方法来构建，则非常困难，甚至不可能，相反，用融合方法则轻而易举。
在胞质杂合体和一般杂合体中，线粒体DNA同叶绿体相比有明显的不同，这些线粒体DNA比亲本的线粒体的DNA具有更普遍的基因变化现象，不论是属间的还是属内的体细胞杂交，常常会发生线粒体DNA的重组。这种现象可以理解为亲本线粒体DNA在异质状态下发生重组。农作物的性状改良，也包括线粒体DNA的重组，在CMS系中导入Ogura细胞质，就是这种情况。在CMS系中，花蜜的产量低于雄性可育系，如果将含高产量花蜜基因的细胞质同CMS融合杂交，则在它们的融合杂合体中出现高产量花蜜的植株。这种现象的发生也是线粒体基因组发生重组的缘故，而且这种高产花蜜的胞质杂合体在田间应用中，作物生物量的生产也有提高。
无性杂交的前景和局限性
无性杂合体的融合在十字花科中获得了成功，这表明了原生质体融合技术在农作物改良上具有巨大的潜力和远大的前景。细胞器的互换和细胞器DNA的重组，使细胞质性质的改良成为可能，使胞质杂合体具有巨大的实用价值。原生质体融合技术克服了原来远缘种间有性杂交的困难，使基因在远缘种间能够进行转导。在无性杂交中转移的性状最好是能够通过对杂合细胞或再生植株的筛选就可分离的性状。也许可以这样认为，原生质体融合，然后进行筛选的方法是多基因性状转移的唯一有效的方法。
但是，对于一些植物种类来说，分离出来的原生质休再生和分化方面存在着很大的困难。虽然进行了大量精细的科研工作，但原生质体培养尚有一定困难。近期，在小麦原生质休的植株再生方面取得重大的进步，还有，从玉米原生质体获得可育性植株。所有这些标志着原生质体融合技术在农作物应用上的重大突破。原生质体融合已成为植物育种的新方法，特别对只有通过融合才能完成植物育种的基因组合，则是唯一的切实可行的方法。
[Tibtech，1991年1月，Vol. 9]